fundal

Boala de dungi brune de manioc apare ca cea mai importanta boala virala a maniocului din Africa si, in consecinta, reprezinta o amenintare la adresa securitatii alimentare. Doua specii distincte din genul Ipomovirus (familia Potyviridae ) cauzeaza boala: virusul urmei brune de manioc (CBSV) si virusul urias de urme brune de manioc (UCBSV). Pentru a intelege relatiile evolutive dintre virusi, au fost determinate 64 de secvente de nucleotide din gena variabila P1 din principalele zone producatoare de manioc din estul si centrul-sudul Africii.

Metode

Am secventiat un amplicon al regiunii P1 a 31 de izolate din Malawi si Tanzania. Pe langa acestea, la analiza au fost adaugate 33 de secvente de virus izolate raportate anterior din Uganda, Kenya, Tanzania, Malawi si Mozambic.

Rezultate

Analizele filogenetice au relevat trei clade majore P1 ale virusilor bruni ai maniocului (CBSV): pe langa o clada a majoritatii CBSV si o clada care contine toate UCBSV, o noua clada intermediara a izolatelor CBSV care a fost numita in mod provizoriu CBSV-Tanzania (CBSV- TZ). Izolatele de virus ale CBSV-TZ distinct au avut identitati nucleotidice de pana la 63,2 si 63,7% cu alti membri ai CBSV si, respectiv, UCBSV.

Concluzii

Gruparea secventelor genetice P1 indicate pentru subpopulatii distincte de CBSV, dar nu UCBSV. Reprezentanti ai tuturor celor trei clade au fost gasiti atat in ​​Tanzania, cat si in Malawi.

Manioca ( Manihot esculenta Crantz, Familia: Euphorbiaceae ) este o cultura alimentara de baza importanta pentru peste 800 de milioane de oameni din intreaga lume [1]. Desi este cunoscut faptul ca manioca este vulnerabila la cel putin 20 de virusi diferiti, cele doua boli virale cele mai daunatoare din punct de vedere economic din Africa sunt boala mozaicului maniocului si boala mariei de manioc (CBSD). Bolile au fost asociate cu pierderi de productie in valoare de peste 1 miliard USD in fiecare an [2]. Evolutiile recente in cercetarea maniocului au aratat ca CBSD apare ca fiind cea mai importanta boala virala a maniocului din Africa si, in consecinta, este o amenintare la adresa securitatii alimentare [1]. Doua specii distincte din genul Ipomovirus (familia Potyviridae ), virusul urmei brune de manioc[3] si virusul ugandian al maniocului (UCBSV [4, 5]) cauzeaza boala. In aceasta lucrare, ambii virusi sunt denumiti in mod colectiv CBSV. Simptomele caracteristice ale CBSV includ cloroza tipica „cu pene” si simptome ale petelor galbene de-a lungul venelor secundare si tertiare ale frunzelor mai vechi de manioc, dungi maronii pe tulpini, constrictie in radacinile de depozitare si pete maronii in tubercul vizibile atunci cand este taiat [6 , 7]. matrimoniale alba24 Anterior, CBSD a fost raportat doar din zonele joase de coasta din Africa de Est, dar recent s-a raspandit in toata regiunea Marilor Lacuri din Africa de Est si Central-Sudica [8,9,10,11,12,13,14].

Potyviridae este o familie de virusuri vegetale cu un singur gen de ARN cu sens pozitiv, genom si particule flexibile, filamentoase [10]. Genomul monopartit + ssRNA al membrilor Potyviridaeimpartasesc o organizare genomica similara, cu niveluri de identitate a aminoacizilor in poliproteinele lor variind de la 42 la 56% intre diferite specii din acelasi gen si de la 25 la 33% in randul virusurilor din diferite genuri [11]. Cu toate acestea, conservarea proteinelor mature individuale variaza. P1, o serina proteaza care se autoclivizeaza la capatul sau C si actioneaza ca factor accesoriu pentru amplificarea genomului (revizuita in [12] este prima proteina a poliproteinei si cea mai variabila in lungime si in secventa de aminoacizi [11]. Altele rolurile P1 includ cresterea activitatii proteazei componente ajutatoare (HCPro) pentru a suprima silentierea ARN [13] si pentru a spori patogenitatea virusurilor plantelor heteroloage in timpul coinfectiei [14, 15]. are functie de suprimare a amortizarii ARN [16].

Variabilitatea genetica este o caracteristica intrinseca a virusilor ARN din cauza ratelor ridicate de mutatie rezultate din lipsa activitatii de corectare a ARN polimerazelor lor dependente de ARN [14, 18]. Evenimentele de recombinare a ARN pot forma suplimentar diversitatea populatiilor de virusi ARN [15], ceea ce poate duce la noi fenotipuri, cum ar fi extinderea intervalului gazda [19]. Diversitatea dintre izolatele CBSV a fost initial evaluata utilizand secvente la capatul 3′-conservat al genomului ARN care cuprinde gena proteinei de acoperire si parti ale NIb [16] in timp ce studiile comparative cu genomuri virale complete [5, 9, 20], au dezvaluit mai multe trasaturi pronuntate si distinctive printre izolatele de virus. Intr-un studiu anterior [5], analiza secventei a 7 izolate de virus a dezvaluit doua clade de secventa CBSV distincte, care au fost separate la nivelul speciei. Diferitele caracteristici biologice ale membrilor acestor doua clade au justificat ca CBSV-urile sa fie atribuite la doua specii: UCBSV si CBSV [5]. In acelasi studiu, a fost identificat un izolat din Tanzania de coasta (CBSV-Tan70, FN434473), care era foarte asemanator cu izolatele CBSV pe o mare parte din genomul sau, dar cu o gena P1 izbitor de diferita, care era asociata echidistant atat cu izolatele CBSV, cat si cu UCBSV. Deoarece aceasta regiune P1 divergenta a fost gasita doar intr-un singur izolat CBSV care altfel avea trasaturi biologice similare cu alte CBSV, nu s-a putut delimita speciile suplimentare din cauza lipsei unor izolate similare. Analizele recente ale secventelor suplimentare ale genomului CBSV din Tanzania [9] si din Uganda [16] au aratat o diversitate suplimentara si indica, de asemenea, potentialul pentru o alta specie sau subspecie in cadrul CBSV.

In studiul prezentat aici, au fost analizate un total de 64 de secvente genetice P1 de izolate CBSV din principalele zone producatoare de manioc din estul si centrul-sudul Africii. escorte casatorite Am secventiat o portiune din gena P1 din 31 de izolate (din Malawi si Tanzania) si le-am analizat cu cele raportate anterior din Uganda, Kenya, Tanzania, Malawi si Mozambic si am prezentat dovezi substantiale pentru aparitia pe scara larga a unei clade distincte a virusului branzei de manioc numit provizoriu CBSV-Tanzania (CBSV-TZ).

Sursa izolatelor de virus, amplificare si secventiere

Butasi de manioc colectati din plante simptomatice CBSD din Malawi si Tanzania (Tabelul 1) in timpul anchetelor nationale din 2013 (sub egida institutelor de cercetare agricola ale fiecarei tari). Plantele au fost clasificate prin simptome care erau in concordanta cu CBSD (cloroza cu pene de-a lungul venelor din frunze si dungi maronii / leziuni de-a lungul tulpinii plantei), sau potential au fost coinfectate cu agenti care cauzeaza atat CBSD, cat si CMD (mozaic, pete, deformate si pliante rasucite ) si au fost duse la Institutul Leibniz – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen si Zellkulturen GmbH (DSMZ) Departamentul pentru virusul plantelor, unde au fost intretinute in conditii de sera. ARN-ul total a fost extras din frunzele infectate cu virus ale plantelor de manioc folosind metoda bromurii de cetil trimetil amoniu [21] cu modificarile descrise anterior [22] sau folosind un kit RNeasy Mini (Qiagen). Acizii nucleici au fost cuantificati utilizand un spectrofotometru Nanodrop si s-a folosit aproximativ 2,0 × 10-5 μg / mL acid nucleic pentru detectarea virusului prin RT-PCR asa cum este detaliat in Winter et al. [5]. Un fragment de ADNc, secventa partiala a genei P1, a fost amplificat folosind seturi de primer specific virus concepute de Winter si colab. [5]. Reactiile au fost efectuate intr-un termociclator GeneAmp 9700 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) setat cu urmatoarele conditii: 42 ° C timp de 30 de minute pentru transcriere inversa, urmata de denaturare termica la 94 ° C timp de 5 minute; si apoi 35 de cicluri de amplificare cuprinzand urmatoarele: denaturare la 94 ° C timp de 1 min, recoacere la 52 ° C timp de 1 min, extindere la 72 ° C timp de 1 min, urmata de un singur ciclu de extensie finala la 72 ° C timp de 10 min. Toate produsele RT-PCR au fost purificate folosind un kit de extractie cu gel Qiagen, ligat in vectorul de clonare pDrive U / A (Qiagen) si ulterior electroporat inCelule DH5α de Escherichia coli . Clonele au fost Sanger secventiate in ambele orientari. O singura secventa consensuala pentru fiecare izolat a fost verificata a fi CBSV prin cautari explozive ale GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. matrimoniale craiova gazeta de sud cgi). Secventele de nucleotide rezultate au fost trimise catre GenBank (numere de aderare in asteptare, Tabelul 1).

Similitudinea nucleotidica si analiza putativa a punctului de intrerupere a recombinarii

Procentul de identitati nucleotidice a fost calculat in Geneious Software v10.0.5 [23]. O matrice de identitati de nucleotide a fost produsa folosind Sequence Demarcation Tool v1 [24]. Evenimente de recombinare putativa au fost detectate folosind noua programe de detectare a recombinarii din cadrul pachetului RDP4 (http://darwin.uvigo.es/rdp/rdp.html): RDP, GENECONV, MaxChi, Chimaera, Bootscan, Siscan, PhylPor, LARD si 3Seq [25]. Analizele au fost efectuate folosind setarile implicite (cu exceptia secventelor care au fost setate la liniare) si corectia Bonferroni, valoarea P -cut de 0,05. Numai punctele de intrerupere sustinute de cel putin trei metode au fost luate in considerare [26].

Analiza filogenetica

A fost determinata relatia filogenetica intre regiunile P1 ale izolatelor CBSV (Tabelul 1). Secventele au fost aliniate folosind ClustalW [27] in MEGA 7 [28] si editate manual. Alinierea a fost taiata pentru a da tuturor secventelor o lungime uniforma. MEGA 7 a fost utilizat pentru a construi arbori filogenetici cu maxima probabilitate (ML), iar editarea a fost facuta in FigTree v1. publicat 24 matrimoniale iasi 4.2 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). Arborii au fost creati folosind un model de substitutie a nucleotidelor GTR, iar cel mai bun arbore a fost bootstrappat cu 1000 de replici [29].

Pentru a examina diversitatea genetica a CBSV-urilor, sondaje de teren si prelevare de probe extinse au fost efectuate in Malawi si Tanzania in 2013, producand un total de 31 de izolate nou secventiate (16 din Tanzania si 15 din Malawi). Alte treizeci si trei de secvente P1 publicate anterior de CBSV-uri au fost recuperate de la GenBank si aliniate cu aceste noi secvente si un taxon suror, virusul usor al cartofului dulce [3]. Alinierea (510 nt) sa dovedit a fi lipsita de recombinare detectabila.

Un copac filogenetic generat din aceste 64 de secvente P1 partiale a confirmat o variabilitate genetica semnificativa in randul CBSV-urilor si a rezolvat fara ambiguitate trei clade. Sapte izolate; cinci din Tanzania (TZ-Nal: 07, TZ_Mari_1_13, TZ: Kor6: 08, TZ-19-1, Tan_70) si doi din Malawi (MW16, MW40) au format o clada care este semnificativ divergenta de alte izolate CBSV (numim acest lucru clade CBSV *) si respectiv izolatele UCBSV (Fig. 1). Am numit provizoriu acest grup CBSV-Tanzania deoarece este mai strans legat de CBSV decat izolatele UCBSV si contine secvente predominant din Tanzania. Clada include izolatul CBSV Tan_70 din coasta Tanzaniei, care a fost raportat anterior [5]. Izolatele apartinand cladei CBSV-TZ au fost strans legate, impartasind secvente genetice P1 foarte diferite de cele din cladele CBSV * si UCBSV (Fig. matrimoniale mures 2).

Intrucat CBSD continua sa ameninte productia de manioc de subzistenta in estul, centrul si sudul Africii, este necesar sa se inteleaga dinamica diversitatii virale, deoarece aceasta are implicatii asupra evolutiei si aparitiei noilor specii sau tulpini. Acest lucru este deosebit de critic in lumina raspandirii rapide a bolii din regiunea Marilor Lacuri din estul si centrul-sudul Africii [8, 9, 11,12,13,13, 20]. Prezentam aici o analiza a 64 de secvente partiale P1 de virusi de marie de manioc din regiunile de crestere a maniocului din Africa, unde se stie ca apar CBSV. Varianta considerabila a dimensiunii si secventei genelor in cadrul genelor P1 din familia Potyviridaea fost raportat anterior [17, 14] indicand faptul ca P1 este o regiune ideala pentru a dezvalui diferentierea populatiei si speciatia incipienta in cadrul ipomovirusurilor de manioc. Mai mult, analiza intregului genom al CBSV-urilor identificase anterior diversitatea neobisnuita a secventei in P1 [5]. Analiza noastra filogenetica a relevat ca secventele CBSV au format trei clade distincte (Figura 1). Pe langa speciile caracterizate anterior UCBSV si CBSV, noua clada care include izolatul Tan_70 [5] prezinta un subgrup major de CBSV, pentru care propunem numele provizoriu CBSV-Tanzania.

Un alt studiu asupra variatiei CBSV-urilor, bazat pe fragmente de proteine ​​cu strat scurt (~ 230 nt) a relevat un numar de virusi intermediari intre cele doua subgrupari de specii CBSV si UCBSV si, in consecinta, a prezentat o posibilitate ipotetica a unei noi specii sau subspecii noi. asociate cu CBSV [30]. curve cernavoda Analize recente ale genomului intreg al izolatelor UCBSV [9] au sugerat speciatii suplimentare intre izolatele UCBSV din Tanzania. Rezultatele noastre, concentrandu-ne pe analiza genei variabile P1 si a izolatelor de virus suplimentare din estul si centrul-sudul Africii, confirma diversitatea observata cu alte studii si ofera dovezi din analiza genei P1 pentru subdiviziunea CBSV si prezenta cladei CBSV-TZ. Rezultatele noastre arata, de asemenea, ca virusurile Malawi si Tanzania sunt mai diverse decat cele gasite in Kenya, Uganda, si Mozambic (Figura 1). Faptul ca Tanzania are o diversitate calitativ mai mare de CBSV nu poate fi doar datorita supravegherii si esantionarii sporite acolo; in timp ce UCBSV este distribuit in tot Malawi, CBSV * si subgrupul CBSV-TZ sunt localizate in nordul Malawi, la granita cu Tanzania [30]. Miscarea soiurilor intre cele doua tari ar putea ajuta la explicarea diversitatii comune a CBSV-urilor, care ar putea fi cauzata fie de motive pur geografice, fie de adaptari unice ale CBSV-TZ circulant la soiurile de manioc populare la nivel local.

In timp ce regiunea din jurul Lacului Malawi a fost locul unde CBSD a fost observata pentru prima data [6] prevalenta mai mare si distributia larga a UCBSV in comparatie cu CBSV in Malawi, Tanzania si tarile inconjuratoare sugereaza ca UCBSV a fost probabil virusul implicat in prima descoperire a CBSD. Comparatiile secventelor genomice complete ale CBSV-urilor din Malawi cu cele ale CBSV-urilor obtinute din zonele afectate de CBSD din tarile vecine (Tanzania si Mozambic) ar clarifica probabil intrebarile cu privire la istoria evolutiei si biogeografia virusurilor din regiune. Indiferent, este clar ca CBSV-urile nu au distributii geografice distincte, asa cum sa presupus anterior [4].

Studii realizate de Ndunguru si colab. [9] a aratat ca un izolat tanzanian CBSV descris anterior TZ-Nal 07 a avut un eveniment de recombinare la capatul 5 ′ in gena P1. Se stie ca regiunea P1 gazduieste o recombinare evidenta in mai multe potivirusuri [31] si contribuie la variabilitatea sa generala. Desi setul nostru de date final nu a sustinut statistic punctele de intrerupere a recombinarii in cadrul P1, cand diferite izolate din Kenya [32] au fost lasate in afara analizei, izolatul (TZ-Nal 07) a fost identificat prin doua metode ca un recombinant putativ membru al cladei CBSV-TZ (TZ: Kor6: 08) si CBSVMo_83 (datele nu sunt prezentate). Acest eveniment de recombinare poate fi mai bine sustinut din setul de date complet al genomului [9], dar constatarea este in concordanta cu plasarea filogenetica a TZ-Nal 07 ca bazala pentru clada CBSV-TZ. In orice caz,

CBSD:

Boala de dungi brune de manioc

CBSV:

Virusul maniei brune de manioc

CBSV-TZ:

Manie bruna de manioc Tanzania

ADNc:

complementar Acid nucleic dezoxiribonucleic

CMD:

Boala mozaicului de manioc

MEGA:

Analiza geneticii evolutive moleculare

ML:

Probabilitate maxima

ARN:

Acid ribonucleic

RT-PCR:

Transcriptaza inversa – Reactie in lant a polimerazei

SDT:

Instrument de demarcare a secventelor

UCBSV:

Virusul ugandian al maniei brune de manioc

Referinte

Suntem recunoscatori tuturor personalului tehnic de la Institutul de Cercetari Agricole Mikocheni, Tanzania si statia de cercetare agricola Chitedze, Malawi, pentru sprijin pentru prelevarea de probe pe teren si colectarea tulpinilor de manioc. Contributia financiara a Fundatiei Bill & Melinda Gates (Granturile nr. 51466 si 1052391) si a Departamentului pentru Dezvoltare Internationala din Marea Britanie este, de asemenea, foarte apreciata.

Finantarea

Recunoastem foarte mult sprijinul financiar complet de la Fundatia Bill & Melinda Gates (subventii nr. 51466 si 1.052.391) si de la Departamentul pentru Dezvoltare Internationala din Marea Britanie, prin subventie acordata Departamentului Serviciilor de Cercetare Agricola (DARS), statia de cercetare agricola Chitedze sub auspiciile al Institutului de Cercetari Agricole Mikocheni (MARI) prin proiectul „Diagnosticul bolilor pentru productia durabila de manioc in Africa”. matrimoniale sighet Niciunul dintre finantatori nu a avut nicio influenta asupra proiectarii, colectarii sau analizei sau interpretarii datelor.

Disponibilitatea datelor si a materialelor

Toate secventele generate au fost depuse in GenBank (KY289995-KY290025).

Contributiile autorilor

WM si FT au colectat probe de manioc, WM, SS, MK si SW au taiat manioc, WM, FT SS, MK si SW izolate si secventiate ARN viral, WM, SD si SW au efectuat analize filogenetice, WM, FT, PS, JN, SD , SM, IB, SS, MK si SW au scris si editat manuscrisul. Toti autorii au citit si au aprobat manuscrisul final.

Interese concurente

Autorii declara ca nu au interese concurente.

Consimtamantul pentru publicare

Nu se aplica

Aprobarea etica si consimtamantul de participare

Nu se aplica

Afilieri

1. Departamentul de ecologie, evolutie si resurse naturale, Universitatea Rutgers, New Brunswick, NJ, 08901, SUA

   Willard Mbewe si Siobain Duffy

2. Scoala de Agricultura si Stiinta Mediului, Departamentul de Productie Agricola, Universitatea Makerere, PO Box, 7062, Kampala, Uganda

   Willard Mbewe & Ssetumba Mukasa

3. Mikocheni Agricultural Research Institute, PO Box 6226, Dar es Salaam, PO, Tanzania

   Fred Tairo, Peter Sseruwagi si Joseph Ndunguru

4. Statia de cercetare agricola Chitedze, caseta postala, 153, Lilongwe, Malawi

   Ibrahim Benesi

5. Institutul Leibniz – Departamentul virusului plantelor DSMZ, Braunschweig, Germania

   Samar Sheat, Marianne Koerbler si Stephan Winter

autorul corespunzator

Corespondenta cu Willard Mbewe.

Acces deschis Acest articol este distribuit in conditiile licentei internationale Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), care permite utilizarea, distributia si reproducerea nelimitata in orice mediu, cu conditia sa oferiti credit corespunzator autorului (autorilor) original (e) si sursei, furnizati un link catre licenta Creative Commons si indicati daca s-au facut modificari. Renuntarea la dedicarea domeniului public Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica datelor puse la dispozitie in acest articol, daca nu se specifica altfel.

Reimprimari si permisiuni